Moving Average Imagej

5 Best Free Focus Stacking Software para Windows Aqui está uma lista do Melhor Software de empilhamento de foco livre para Windows. Estes softwares são úteis para fotógrafos, especialmente durante o processamento de fotos macro ou fotos microscópicas. Em quase todo o software mencionado, o processo para focar fotos de pilha é realizado carregando várias imagens e, em seguida, executando a ferramenta de pilha. Este software detecta as partes mais bem focadas das imagens e, em seguida, combine-as para formar uma única imagem. Todo o software de apontar o foco de referência tem GUI exceto um, que é uma ferramenta de empilhamento de foco de linha de comando. Alguns desses softwares também alinham automaticamente as imagens se estiverem fora do alinhamento, o que é um ótimo negócio se você não tiver um tripé para clicar nas fotos. Se você já possui um conjunto de fotos para empilhar, então continue, forneça o software listado uma tentativa. Este software também realiza várias outras operações, mas o foco do artigo foi mantido no empilhamento de imagens de imagens. Enquanto você conhecerá o software de empilhamento de foco listado, você também saberá como fazer o empilhamento de foco com eles. O empilhamento de foco é o processo de empilhamento de várias fotos com áreas focadas de forma diferente, capturadas a partir de uma única posição. O software de empilhamento de foco listado neste artigo realiza o trabalho de empilhamento de foco muito facilmente com resultados satisfatórios. Meu software de empilhamento de foco favorito: eu gosto do Picolay e do TuFuse como ferramentas de empilhamento de foco livre. O Picolay permite que você realize facilmente o empilhamento de fotos, mesmo que você tenha várias imagens para pilha e estão fora de alinhamento. TuFuse é uma ferramenta de empilhamento de foco de linha de comando e consegue fornecer excelente saída empilhada. Eu recomendaria TuFuse se você tiver imagens perfeitamente alinhadas. Picolay é um incrível software de empilhamento de foco para Windows. É leve e executa o processo de empilhamento com muita rapidez. Tudo o que você precisa fazer é adicionar um conjunto de imagens com foco diferente a este software e, em seguida, empilá-los para obter uma saída focada de forma uniforme. O processo de empilhamento de foco funciona melhor para conjuntos de imagens Macro e Microscópicas a partir de um ponto fixo. Se você não tiver um conjunto de fotos pronto para empilhamento, você pode consultar as dicas e truques para fotografar fotos para empilhamento de foco para obter imagens perfeitas para o processo. Se suas fotos estiverem prontas para serem empilhadas, você pode confiar neste software, mesmo que suas imagens estejam fora de alinhamento. O recurso de alinhamento automático funciona muito bem e pode ser invocado. Além do empilhamento de foco, você também pode realizar outros tipos de empilhamento aqui. Estes são: empilhamento baseado em cores, imagens médias marcadas, brilho de ajuste automático, ajuste o equilíbrio de branco, adicione imagens, campo plano, divida pela 1ª imagem. Etc. Como fazer o Stacking do foco usando o Picolay: depois de abrir o software, vá para a guia Arquivo para adicionar imagens. Selecione e adicione um conjunto de imagens que you8217d gostaria de concentrar a pilha. As imagens adicionadas são exibidas como uma lista, clique em uma imagem para visualizá-la. Agora, vá para a guia Operações de pilha e clique em Pilha com os parâmetros atuais. Isso empilha suas imagens em nenhum momento e exibe a saída na tela de visualização de saída. Se você não obteve resultados satisfatórios por causa do erro de alinhamento, ou se a saída tiver ruído, você pode alterar os parâmetros de empilhamento em Operações de pilha gt Definir os parâmetros de empilhamento. Aqui você pode definir a supressão de ruído, o filtro inteligente, o quadro Prefer HighLow, Alinhar imagens, melhorar automaticamente e salvar o mapa de profundidade. Depois de obter uma saída desejada após o empilhamento de foco, você pode salvar a imagem de saída de File gt Save Result As em formatos gif, png, jpg, png, bmp, tif, ico, emf ou wmf. O conjunto de imagens que usei para testar estava fora de alinhamento no entanto, esse software de empilhamento de foco cuidou muito bem. Além do empilhamento, você também pode criar GIF a partir de um conjunto de imagens. Carregue as imagens e vá para a guia Lista de imagens para criar o GIF. Você também pode criar mapas de profundidade e vistas 3D a partir de um conjunto de imagens com este freeware. Este software é gratuito para uso apenas para fins comerciais. O TuFuse é um surpreendente software de empilhamento de linha de comando gratuito. Ele combina as partes mais bem focadas de tiros múltiplos e produz imagens de saída focadas de forma uniforme. Não só foco, mas também combina as partes bastante expostas de múltiplas imagens. Então, o resultado final é uma combinação das partes mais bem focadas e expostas das imagens adicionadas. O algoritmo implícito aqui funciona muito bem e dá resultados incríveis sempre. Não possui uma GUI e você terá que usar determinado conjunto de comandos para executar o processo de empilhamento de foco. Se você realmente não está confortável com a realização de operações de linha de comando, você pode baixar o PTAssembler. Que é um software de costura de imagem, o TuFuse vem junto com ele e serve como GUI para TFuse. Para aqueles que se sentem confortáveis ​​com operações de linha de comando, here8217s como focar imagens de stitch usando TuFuse na linha de comando: Abra a pasta de download onde TuFuse é baixado e abra a pasta TuFuse. Transfira as imagens a serem empilhadas nesta pasta. Agora vá para a barra de endereço da pasta TuFuse, selecione e exclua o caminho da pasta, então digite CMD e pressione Enter. Isso abrirá o prompt de comando com o diretório TuFuse. Agora, digite o seguinte comando para focar imagens de pilha: tufuse - o output. tif input1.tif input2.tif input3.tif input4.tif. E pressione Enter. (Na saída do comando acima é o nome do arquivo de saída, e input1, input2 e input3 são os nomes dos arquivos de entrada.) A saída será salva na própria pasta TuFuse. A saída sempre será um arquivo TIF no entanto, a entrada pode ser jpeg, png, bmp ou tif. Existem várias operações relacionadas à imagem que você pode realizar junto com o empilhamento focal, como: manipulação de níveis, manipulação de contraste de saturação, etc. Para executar estas operações, você precisa adicionar códigos especiais juntamente com a linha de código acima. A lista de códigos pode ser encontrada na página inicial deste software. É um freeware muito fácil de usar, que produz resultados de empilhamento de fotos excepcionais. ImageJ (Stack Focuser Plugin) ImageJ é um software de processamento de imagem multiplataforma que pode realizar o empilhamento de foco de graça. É um software de empilhamento de foco de código aberto que é executado em Java. O recurso para empilhar fotos não vem inbuit mas está disponível como um plugin. A página Plugin deste software possui uma lista muito grande de plugins que podem ser usados ​​para manipular fotos, uma delas é o Stack Focuser. Faça o download do plugin, copie o arquivo baixado e cole-o na pasta Plugins do ImageJ. Agora, para empilhar imagens, abra o software e carregue as imagens a serem empilhadas, uma a uma. Uma vez que todas as imagens estão abertas, clique no botão Stk na barra de ferramentas do ImageJ e, em seguida, clique na opção Imagem para pilha. Isso transforma todas as imagens abertas em uma pilha. Agora vá para a guia Plugins e clique em Stack Focuser. Uma pequena caixa de diálogo é aberta, clique em OK. A sua pilha de imagens é processada para criar uma nova saída empilhada de foco. Salve a imagem como tif, gif, jpg, png, bmp. Etc. O tempo total para focar imagens de pilha, incluindo o tempo para adicionar plugins foi muito menor, e o processo foi executado muito bem. Você pode descobrir um monte de plugins para manipular imagens usando ImageJ. Visite a Página do Plugin ImageJ. CombineZP é um software incrível para o empilhamento de imagens. A interface deste software de empilhamento de foco é bastante liso e fácil de usar. Basta carregar as imagens que deseja empilhar e, em seguida, selecione a opção para empilhar imagens. Antes de continuar com o empilhamento, você pode alinhar as imagens carregadas se as imagens estiverem fora de alinhamento. Se suas imagens já estão em alinhamento, selecione a opção So Stack e clique em Ir. O foco de saída empilhada é armazenado na pasta de saída. A pasta de saída é criada onde o software é armazenado. A imagem empilhada era nítida, sem partes fora do foco. Agora, juntamente com o empilhamento de foco, você também pode executar vários outros tipos de empilhamento de imagens. A lista inclui: Soft Stack, Média ponderada, Pyramid Weighted Average, Pyramid Stack e Pyramid Maximum Contraste. Você também pode carregar outras ações que estão disponíveis como Macros. Uma janela de Ajuda aparece quando você inicia este software. Esta janela tem vários procedimentos e exemplos para ensinar-lhe como funciona este freeware. Chasy Draw IES Chasy Draw IES é um software de processamento de imagem gratuito para usar para editar e manipular imagens. Tem uma enorme lista de ferramentas e uma das ferramentas ajuda você a concentrar fotos de pilha no PC. Outras ferramentas são genéricas e podem ser encontradas na maioria dos editores de imagens e manipuladores. Vamos nos concentrar na ferramenta de empilhamento de foco. Tudo o que você precisa fazer é abrir os vários arquivos a serem empilhados neste software. Uma vez que as imagens estão abertas, vá para Processos gt Stack. Foco empilhável. A imagem processada será exibida no espaço de trabalho. Para salvar a imagem, vá para FilegtSave. A imagem empilhada pode ser salva nos formatos cd5, bmp, ani, gif, gtx, ico, jpg, jp2, pcx, png, tga e tiff. Juntamente com o empilhamento Focus, ele também oferece várias outras opções de empilhamento de imagens. Estes são: média de imagem, HDR de imagem, objetos em movimento, super resolução e Alpha Unabled. November 04, 2010 A seguinte informação é uma versão atualizada de um método para usar o ImageJ para analisar Western Blots a partir de uma página antiga agora obsoleta. Se você estiver procurando por uma opção de fluxo de trabalho mais abrangente para suas análises Western Blot, visite meu tutorial sobre o uso do Image Studio Lite. Um pacote de software gratuito da LI-COR Biosciences. O software Image Studio Lite pode ser baixado gratuitamente do licorislite. Além da funcionalidade descrita abaixo para o ImageJ, o Image Studio Lite fornece recursos adicionais de gerenciamento de dados juntamente com ferramentas de anotação para produzir imagens prontas para publicação de seus westerns. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) pode ser usado para comparar a densidade (aka intensidade) das bandas em um gel de agar ou western blot. Este tutorial assume que você carregou seu gel ou mancha através do passo de visualização, de modo que você tenha uma imagem digital do seu gel em. tif. Jpg. Png ou outros formatos de imagem (um. tif de 16 bits seria o formato preferido para manter a quantidade máxima de informações na imagem original). Se você estiver digitalizando filmes de raios-x em um scanner de mesa, certifique-se de usar um scanner com a capacidade de digitalizar transparências (ou seja, filme) e use o software do scanner para economizar imagens tiff de 16 bits. Veja as referências no final deste tutorial para uma discussão sobre as várias formas em que você pode estragar esse passo. Isso também pressupõe que você não expôs sua imagem de borrão quando você a produziu. Para uma explicação de por que a superexposição irá arruinar seus resultados, veja esta página. O método descrito aqui usa o método de Análise de Gel descrito na documentação ImageJ: Análise de Gel. Você pode preferir usá-lo em vez dos métodos que descrevemos abaixo. Deve haver pouca diferença entre os resultados obtidos nos vários métodos. Esta versão do tutorial foi criada usando o ImageJ 1.42q em uma instalação de Windows 7 de 64 bits. 1. Abra o arquivo de imagem usando FilegtOpen no ImageJ. 2. A rotina de análise de gel exige que a imagem seja uma imagem em escala de cinza. O método mais simples para converter em grayscale é ir para ImagegtTypegt8-bit. Sua imagem deve se parecer com a Figura 1. Figura 1. Uma imagem de Western blot fabricada aberta no ImageJ. A informação ao longo da parte superior da imagem indica que a imagem está atualmente no modo de 8 bits, usando uma LUT (tabela de consulta) inversa. O LUT inversor assegura que bandas escuras serão gravadas como valores de densidade mais alta. 3. Escolha a ferramenta Seleções retangulares na barra de ferramentas ImageJ. Desenhe um retângulo em torno da primeira pista. ImageJ pressupõe que suas pistas funcionam verticalmente (então as bandas individuais são horizontais), então seu retângulo deve ser alto e estreito para incluir uma única pista. Se você desenhar um retângulo curto e largo, o ImageJ mudará para assumir que as pistas funcionam horizontalmente (as bandas individuais são verticais), levando a muita confusão. Figura 2. A primeira linha foi selecionada com a ferramenta Seleção Retangular 4. Depois de desenhar o retângulo ao longo da sua primeira faixa, pressione a tecla 1 (Comando 1 no Mac) (Comando 1 no Mac) ou vá para AnalyzegtGelsgtSelecione Primeira Linha para configurar o Retângulo no lugar. A 1ª pista será agora destacada e terá 1 no meio dela. 5. Use o mouse para clicar e segurar no meio do retângulo na 1ª pista e arraste-o para a próxima pista. Você também pode usar as teclas de seta para mover o retângulo, embora isso seja mais lento. Centre o retângulo sobre a pista de esquerda para a direita, mas don8217t se preocupe em alinhá-lo perfeitamente no mesmo eixo vertical. Image-J alinhará automaticamente o retângulo no mesmo eixo vertical que o primeiro retângulo no próximo passo. 6. Pressione 2 (Command 2 no Mac) ou vá para AnalyzegtGelsgtSeleccionar Next Lane para configurar o retângulo no lugar na 2ª pista. Um 2 aparecerá na pista quando o retângulo for colocado. 7. Repita as etapas 5 6 para cada pista subseqüente no gel, pressionando 2 (Comando 2 no Mac) cada vez para configurar o retângulo no lugar (Figura 3). Figura 3. Coloque o retângulo em cada pista, pressionando 2 cada vez para configurar o retângulo no lugar. 8. Depois de configurar o retângulo na última faixa (pressionando 2), pressione 3 (Comando 3 no Mac) ou vá para AnalyzegtGelsgtPlot Lanes para desenhar um gráfico de perfil de cada faixa. Figura 4. O gráfico de perfil do exemplo western blot. 9. O gráfico do perfil representa a densidade relativa do conteúdo do retângulo em cada pista. Os retângulos estão dispostos de cima para baixo na trama do perfil. No exemplo Western blot image, os picos no gráfico de perfil (Figura 4) correspondem às bandas escuras na imagem original (Figura 3). Como havia quatro pistas selecionadas, existem quatro seções na trama do perfil. Os picos mais altos representam bandas mais escuras. Os picos mais altos representam bandas que cobrem um tamanho maior no gel original. 10. As imagens de géis reais ou western blots sempre terão algum sinal de fundo, então os picos don8217t alcançam a linha de base da trama do perfil. A Figura 5 mostra um pico de uma mancha real onde houve algum ruído de fundo, então o pico parece flutuar acima da linha de base da trama do perfil. Será necessário fechar o pico para que possamos medir seu tamanho. Figura 5. As transferências de Western reais geralmente têm algum ruído de fundo, então o pico não atinge a linha de base (branco perfeito). 11. Escolha a ferramenta de seleção Straight Line na barra de ferramentas ImageJ (Figura 6). Para cada pico que você deseja analisar no gráfico do perfil, desenhe uma linha na base do pico para encerrar o pico (Figura 5). Esta etapa exige algum julgamento subjetivo de sua parte para decidir onde o pico termina e o ruído de fundo começa. Figura 6. Use a ferramenta de linha reta para fechar a base de cada pico de interesse. Figura 7. O pico da Figura 5 é mostrado com uma linha desenhada através da base do pico para encerrar a área do pico. 12. Note que, se você tiver muitas pistas destacadas, as faixas posteriores serão ocultas na parte inferior da janela do gráfico de perfil. Para ver essas pistas, pressione e mantenha pressionada a barra de espaço e use o mouse para clicar e arraste o perfil para cima. 13. Quando cada pico foi fechado na base com a ferramenta Seleção de Linha Direita, selecione a ferramenta Varinha na barra de ferramentas ImageJ (Figura 8). Figura 8. Escolha a ferramenta Varinha para realçar cada pico de interesse no gráfico de perfil. 14. Usando a barra de espaço e o mouse, arraste o plano de perfil para baixo até você voltar na primeira faixa. Com a ferramenta Varinha, clique dentro do pico (Figura 9). Repita isso para cada pico à medida que você desce o gráfico do perfil. Para cada pico que você realce, as medidas devem aparecer na janela de resultados que aparece. Figura 9. Clique dentro do 1º pico de interesse com a ferramenta Varinha. O pico deve ser destacado e uma medida deve aparecer na janela de resultados. 15. Quando todos os picos foram destacados, vá para AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Isso rotula cada pico com seu tamanho, expresso como uma porcentagem do tamanho total de todos os picos destacados. 16. Os valores da janela Resultados (Figura 10) podem ser movidos para uma planilha de planilhas selecionando EditgtCopy All na janela Results. Cole os valores em uma planilha. Figura 10. A saída da seleção de picos no gráfico de perfil e rotulando os picos. Nesse caso, os resultados são de selecionar a banda superior em cada uma das 4 pistas no exemplo western blot da Figura 1. Nota: Se você clicar acidentalmente no lugar errado com a Varinha. O programa ainda registra essa área clicada como um pico e fator na área total usada para calcular os valores de porcentagem. Obviamente, isto irá distorcer seus resultados se você clicar em áreas que aren8217t picos. Se você clicar no lugar errado, basta ir para AnalyzegtGelgtLabel Peaks para traçar os resultados atuais, que exibe os valores incorretos, mas mais importante reafirma o contador para a janela de Resultados. Volte para a trama do perfil e comece a clicar dentro dos picos novamente, começando com o 1º pico de interesse. A janela Resultados deve ser limpa e começar a mostrar seus novos valores. Quando você precisa ter certeza de que você deve clicar em todos os picos corretos sem clicar acidentalmente em áreas erradas, você pode voltar aos Picos AnalyzegtGelsgtLabel e obter os resultados corretos. Análise de dados Com seus dados colados em uma planilha, agora você pode calcular a densidade relativa dos picos. Como lembrete, os valores calculados pelo ImageJ são números essencialmente arbitrários, eles só têm significado no contexto do conjunto de picos que você selecionou na imagem de gel em que o you8217ve estiver trabalhando. Eles não possuem unidades de g de proteína ou qualquer outra unidade do mundo real que você possa pensar. O procedimento normal é expressar a densidade das faixas selecionadas em relação a alguma faixa padrão que você também selecionou durante esse processo. 1. Coloque seus dados em uma planilha. Um dos picos deve ser o seu padrão. Neste exemplo, usamos o 1º pico como padrão. 2. Em uma nova coluna ao lado da coluna Percentagem, divida o valor de porcentagem para cada amostra pelo valor de porcentagem para o padrão (o primeiro pico neste caso, 26.666). 3. A coluna de valores resultante é uma medida da densidade relativa de cada pico, em comparação com o padrão, o que, obviamente, terá uma densidade relativa de 1. Figura 11. Cálculo da densidade relativa para cada um dos 4 picos destacados. Usamos a Amostra 1 como padrão para este gel. A densidade relativa é calculada dividindo o valor de porcentagem para cada amostra pelo valor de porcentagem para o padrão. 4. Neste exemplo, a 2ª pista possui uma maior Densidade Relativa (1,86), o que corresponde bem ao tamanho e escuridão dessa banda na imagem original (Figura 1). Lembre-se de que esses dados são para a linha superior de bandas na imagem western blot original. 5. Se você deseja comparar a densidade de amostras em vários géis ou manchas, você precisará usar a mesma amostra padrão em cada gel para fornecer uma referência comum quando você calcula valores de Densidade Relativa. Veja as seções abaixo para uma discussão mais detalhada sobre esses requisitos. 6. Para testar diferenças significativas entre tratamentos em um experimento, todos os seus géis ou manchas precisarão ser verificados e quantificados usando este método, e os valores serão expressos em termos de Densidade Relativa ou você pode tratar Densidade Relativa Como um valor de mudança de dobra (ou seja, uma diferença de densidade relativa de 2 entre um controle e tratamento indicaria uma mudança de 2 vezes na expressão). Se você estiver usando técnicas de análise de variância para testar seus dados, você precisará garantir que seus valores de Densidade Relativa sejam normalmente distribuídos e que haja homogeneidade de variância entre os diferentes tratamentos. 7. Deve-se notar aqui que alguns pesquisadores fazem o esforço extra para incluir um conjunto de diluições em série de um padrão conhecido em cada mancha. Usando a curva de diluição em série e as técnicas de quantificação descritas acima, deve ser possível expressar suas bandas de amostra em termos de picogramas ou nanogramas de proteínas. Um exemplo mais envolvente usando os controles de carga. Usamos a Figura 12 como uma mancha Western representativa. Com esta mancha, vamos fingir que carregamos quatro amostras repetidas de proteínas (quatro cargas de pipeta do mesmo frasco de homogeneizado), então esperamos que as densidades em cada pista sejam equivalentes. A linha superior de barras representará nossa proteína de interesse. O conjunto inferior de barras representará nossa proteína de controle de carga, que deve garantir que uma quantidade igual de proteína total foi carregada em cada pista. Esta proteína de controle de carga é uma proteína que é presumivelmente expressa a um nível constante, independentemente do tratamento aplicado aos organismos originais, como a actina (embora muitas pessoas periquem a afirmação de que a actina será expressa de forma equivalente em todos os tratamentos). Figura 12. Um exemplo de Western Blot com uma linha inferior de bandas de controle de carga. Muitas vezes, essas bandas representarão uma proteína que se pensa ser expressa de forma equivalente em todos os tratamentos, como a actina. Olhando para a Figura 12, esperávamos carregar quantidades equivalentes de proteína total em cada pista, mas depois de executar a mancha Western, o tamanho e a intensidade das barras inferiores em cada faixa varia bastante. As duas faixas esquerdas parecem equivalentes, mas a 3ª faixa tem metade da densidade (valor cinza) em comparação com as pistas 12, enquanto a pista 4 tem metade da densidade e metade do tamanho em comparação com as pistas 12. Como nossos controles de carga são tão diferentes, a densidade Os valores do conjunto superior de bandas podem não ser diretamente comparáveis. Utilizamos a rotina de análise de gel ImageJ8217 para quantificar a densidade eo tamanho das manchas e usar os resultados de nossos controles de carga (bandas inferiores) para dimensionar os valores de nossa proteína de interesse (bandas superiores). 1. Abra a imagem western blot no ImageJ. 2. Certifique-se de que a imagem está no modo de 8 bits: vá para ImagegtTypegt8-bit. 3. Use a ferramenta retângulo para desenhar uma caixa em torno de toda a faixa 1 (barras superior e inferior incluídas. 4. Pressione 822018221 (ou Comando 1 no Mac) para definir o retângulo. Um 822018221 deve aparecer no meio do retângulo. 5. Clique e segure no meio do retângulo e arraste-o sobre a 2ª pista. 6. Pressione 822028221 (Comando 2 no Mac) para definir o retângulo para a faixa 2. Um 822028221 deve aparecer no meio do retângulo. Repita as etapas 5 6 para cada faixa subseqüente, pressionando 822028221 (Comando 2 no Mac) para definir o retângulo em cada faixa subseqüente (veja a Figura 13). Figura 13. Cada faixa foi selecionada movendo o retângulo sobre ele e pressionando 822028221 para configurar 8. Quando você colocou a última faixa (e pressionou 822028221 para colocá-la no lugar), você pode pressionar 822038221 para produzir uma trama das pistas selecionadas (veja a Figura 14). Figura 14. Gráfico do perfil de cada uma Lane (arrumada com a linha 1 no topo, a pista 4 na parte inferior). Você precisará percorrer t Ele janela para ver todas as pistas. 9. O gráfico de perfil representa essencialmente o valor de densidade média em um conjunto de fatias horizontais de cada faixa. As manchas mais escuras terão picos mais altos, e as manchas que cobrem um tamanho maior (KD) terão picos mais largos. Em nosso exemplo western blot, as bandas são retângulos perfeitos, mas você notará alguma inclinação nos picos do perfil, pois o ImageJ está aplicando um pouco de média dos valores de densidade à medida que ele se move de cima para baixo de cada pista. Como resultado, a transição acentuada do preto perfeito para o preto perfeito nas bandas da pista 1 é traduzida em uma ligeira inclinação na trama de perfil devido à média. 10. Na nossa Western Blot idealizada usada aqui, não há ruído de fundo, então o pico atinge todo o caminho até a linha de base da trama do perfil. Em borrões de Western reais, haverá algum ruído de fundo (o fundo não será perfeitamente branco), então os picos won8217t atingem a linha de base do gráfico de perfil (veja a figura 5 acima). Como resultado, cada parcela precisará ter uma linha desenhada na base do pico para fechá-la. 11. Escolha a ferramenta de seleção Straight Line na barra de ferramentas ImageJ. Para cada pico que você deseja analisar no gráfico do perfil, desenhe uma linha na base do pico para encerrar o pico (Figura 7). Esta etapa exige algum julgamento subjetivo de sua parte para decidir onde o pico termina e o ruído de fundo começa. 12. Quando cada pico de interesse é fechado com a ferramenta de linha reta, mude para a ferramenta Varinha. Usaremos a ferramenta varinha para destacar cada pico de interesse para que Image-J possa calcular sua capacidade relativa. 13. Vamos começar por destacar as bandas de controle de carga (linha inferior) em nosso western blot de exemplo. Começando na parte superior do gráfico de perfil, use a varinha para clicar dentro do 1º pico (Figura 15). O pico deve ser destacado depois de clicar nele. Continue clicando nos picos de controle de carga para as outras pistas. Se uma faixa não estiver visível na parte inferior do gráfico de perfil, mantenha pressionada a barra espaciadora e clique e arraste o perfil para cima para revelar as pistas restantes. Figura 15. Clique dentro do pico de controle de carga com a ferramenta varinha. Clique em cada um dos picos de controle de carga para as pistas restantes (ignore as pistas da proteína para a esquerda por agora). 14. Quando o pico de controle de carga para cada pista foi destacado com a varinha, vá para os picos AnalyzegtGelgtLabel. Cada pico destacado será rotulado com o seu tamanho relativo expresso como uma porcentagem da área total de todos os picos destacados. Você pode ir para a janela Resultados e escolher EditgtCopy Tudo para copiar os resultados para colocação em uma planilha. Figura 16. Valores de Área e Percentagem para nossas bandas de controle de carga a partir do exemplo western blot. As linhas 1 e 2 são iguais, como esperamos, observando as bandas originais no western blot (Figura 12). 15. Repita as etapas 13 14 para os picos de amostra reais agora. Estamos selecionando esses picos separadamente dos picos de controle de carga para que essas áreas não sejam incluídas no cálculo da densidade de nossas proteínas de interesse. Como antes, use a ferramenta Varinha para clicar dentro da área do pico na 1ª pista e continue clicando dentro dos picos das pistas restantes. Quando terminar, vá para AnalyzegtGelgtLabel Peaks para mostrar os resultados. Copie os resultados para uma planilha juntamente com os dados para as bandas de controle de carga (Figura 17). Figura 17. Resultados das bandas de controle de carga (rotuladas como 8220stds8221 aqui) e os picos de proteínas de amostra (a linha superior de bandas no western blot original). Análise de dados com bandas de controle de carga 1. Com todos os valores de densidade relativa agora na planilha, podemos calcular as quantidades relativas de proteína no Western Blot. Lembre-se de que os valores 8220Area8221 e 8220Percent8221 retornados pelo ImageJ são expressos como valores relativos, baseados apenas nos picos que você destacou no gel. Inicie a análise calculando os valores de Densidade Relativa para cada uma das bandas padrão de carregamento. Neste caso, vamos fingir que a Lane 1 é nosso controle que queremos comparar as outras 3 pistas para. Divida o valor de porcentagem para cada faixa pelo valor de porcentagem no controle (Pista 1 aqui) para obter um conjunto de valores de densidade relativo à quantidade de proteína na faixa de carga-controle da pista 18217s (Figura 18). Figura 18. Calcule os valores de Densidade Relativa dividindo os valores percentuais em cada linha pela amostra de controle8217s Valor percentual (Pista 1, 40.828, em nosso exemplo). 2. Em seguida, calculamos os valores de densidade relativa para as nossas bandas de proteína de amostra (linha superior no exemplo western blot). Realizamos um cálculo semelhante ao passo 1, dividindo o valor de porcentagem em cada linha pelo valor de porcentagem da nossa banda de proteínas do controle8217s (Pista 1 aqui). Figura 19. Calcule valores de densidade relativa para as amostras também, usando o valor de porcentagem para sua banda de proteína de controle (Lane 1, 40.585 aqui). Nota: Lembre-se de que, como algumas de nossas bandas de controle de carga eram extremamente diferentes no western blot original, podemos simplesmente usar os valores de Densidade Relativa de nossas Amostras calculadas na Etapa 2 como os resultados finais. Agora é necessário dimensionar os valores de Densidade Relativa para as Amostras pela Densidade Relativa das correspondentes bandas de controle de carga para cada faixa. Fazemos isso com base no pressuposto de que as diferenças proporcionais nas Densidades Relativas das bandas de controle de carga representam as diferenças proporcionais em quantidades de proteína total que carregamos no gel. Em nosso exemplo Western blot, temos evidências de quantidades massivamente diferentes de proteína total em cada amostra (prática de pipetagem pobre, provavelmente). 3. O passo final é dimensionar nossas Densidades Relativas à Amostra usando as Densidades Relativas dos controles de carga. Na planilha, divida a densidade relativa da amostra de cada faixa pela densidade relativa de carga-controle para a mesma pista. Figura 20. Os valores de densidade ajustada (células amarelas) para nossas amostras foram calculados dividindo a Densidade Relativa de cada faixa de Amostra pela Densidade Relativa do controle de carga para a mesma pista. Por exemplo, a Densidade Relativa para a Amostra 4 (0.1628) foi dividida pela Densidade Relativa para o controle de carga na Pista 4 (0.154379) para obter um valor de Densidade Ajustada de 1.054. 4. Quando criamos nosso exemplo imaginário Western Blot, esperávamos obter quantidades equivalentes da proteína de interesse em cada pista, porque nós (hipoteticamente) carregamos volumes equivalentes de amostras de proteína do mesmo frasco de homogeneizado em cada pista. Durante o processo de carregamento, algo deu errado, e obtivemos densidades muito diferentes no western blot. Mas depois de realizar as correções de controle de carga acima, achamos que nossas Densidades Ajustadas para cada uma das 4 pistas são aproximadamente equivalentes (todas são aproximadamente 1), indicando que há proporções equivalentes da proteína de interesse contida na amostra do total Proteína em cada pista, como seria de esperar. O exemplo acima representa um caso especial. Na realidade, você normalmente estará habilitado o suficiente para pipetar quantidades equivalentes de proteína total em suas pistas de gel, presumivelmente porque você usou um processo como o Ensaio de Proteína BCA para quantificar a quantidade total de proteína presente em cada uma de suas amostras de homogeneizado. Isso pode evitar a necessidade de bandas de controle de carga e a controvérsia associada sobre se a proteína que você usa para avaliar o carregamento igual é realmente expressa consistentemente em todos os níveis de tratamento. Extendendo o exemplo para múltiplas manchas de Western Se você pode aplicar quantidades iguais de proteína total a cada pista de um gel, então você só precisa se preocupar em ter uma amostra padrão apropriada colocada em cada mancha de Western que corre para o projeto. Por exemplo, você pode comprar uma alíquota de Human Hsp70 purificado e colocar 1l em uma pista em cada gel que você executa ao sondar o Hsp70. Ou você pode economizar algum dinheiro criando sua própria amostra padrão, misturando alíquotas de vários dos seus homogeneizados para criar uma grande quantidade de homogeneizado misturado que você pode usar para carregar um volume padrão em uma única linha de cada gel para todo o projeto (executando Fora dessa mistura, parte de seu projeto seria uma coisa ruim). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed.